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고정 기하학은 키네신의 방향을 결정하는 중요한 요소입니다.

Mar 27, 2024

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 15417(2022) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

키네신-14 미세소관 기반 모터는 촉매 코어를 부하에 부착하는 N 말단 꼬리를 가지며 일반적으로 미세소관 마이너스 끝쪽으로 이동하는 반면, 대부분의 다른 키네신은 C 말단 꼬리를 갖고 플러스 끝쪽으로 이동합니다. 모터 도메인 외부의 보존된 서열이 손실되면 키네신-14가 플러스 엔드 운동성으로 전환되어 N 말단 부착이 플러스 엔드 운동성과 호환된다는 것을 보여줍니다. 그러나 마이너스 말단 운동성에서 부착 위치의 역할에 대한 체계적인 연구는 없습니다. 따라서 우리는 부착 지점에서만 다른 단량체성 키네신-14의 운동성을 조사했습니다. 우리는 C 말단 부착 지점이 키네신-1과 유사한 운동성 분석에서 미세소관 코르크 마개 회전 방향과 피치를 사용하여 키네신-14가 플러스 엔드 방향이 된다는 것을 발견했습니다. 이는 C-키네신 키네신-14와 N이 모두 -kinesin kinesin-1은 본질적인 플러스 엔드 편향과 함께 고도로 보존된 촉매 핵심 기능을 공유합니다. 따라서 N-말단 부착은 키네신-14의 마이너스 말단 운동성에 대한 요구 사항 중 하나입니다.

미세소관을 따른 키네신 모터 단백질의 단방향 이동은 소기관 수송 및 세포 분열을 포함한 진핵생물의 많은 세포 과정에서 중요합니다. 일반적으로 운동 영역이 N 말단 부분에 위치한 키네신-1~-10 및 -12와 같은 대부분의 N-키네신은 미세소관 플러스 말단쪽으로 이동하는 반면, 키네신-14와 같은 일부 C-키네신은 모터 도메인이 C 말단 부분에 있는 경우 미세소관 마이너스 끝쪽으로 이동합니다1,2. 그러나 모든 키네신이 이러한 순전히 단방향 운동성을 갖는 것은 아니며 최근 효모와 곰팡이의 일부 키네신에서 방향 전환이 관찰되었습니다. 일반적으로 플러스 엔드 방향인 일부 키네신-5, N-키네신은 미세소관의 마이너스 엔드 쪽으로 이동하고 다양한 조건에서 방향성을 전환하는 놀라운 능력을 가지고 있는 반면 일부 키네신- 14(일반적으로 마이너스 방향으로 향하는 C-키네신)은 상황에 따른 양방향성을 보여줍니다8,9. 세로 운동성의 반대 방향에도 불구하고 키네신-1과 같은 N-키네신과 키네신-14와 같은 C-키네신의 촉매 코어는 3D 구조와 아미노산 서열에서 현저하게 유사합니다. 또한 키네신-112, -213, -314, -515, -616, -817 및 C-키네신 키네신-1418과 같은 N-키네신도 토크를 생성하며, 이는 세로 운동성과 함께 다음을 초래합니다. 표면에 고정된 모터 배열을 가로질러 미끄러지는 미세소관의 코르크마개 같은 전위. 미세소관에서 개별 원형필라멘트를 정확하게 추적하는 진행성 이량체 키네신-1을 제외하고, 플러스 끝 방향 N-키네신은 미세소관12의 왼쪽 코르크 마개 뽑기 운동을 구동하는 반면, 마이너스 끝 방향 키네신-14 Ncd 오른손잡이 코르크 마개 뽑기 동작을 구동합니다18. 방향에 따른 코르크 마개 손잡이의 반전은 키네신 운동성의 측면 토크 생성 구성 요소가 두 유형의 모터에서 정확히 동일하다는 것을 나타냅니다 (보조 그림 1) .

촉매 코어 구조 및 기능의 유사성과는 대조적으로, 키네신-1과 키네신-14는 촉매 코어의 C-말단과 N-말단에 인접한 고유한 영역을 가지고 있습니다(그림 1a 및 보충 그림 2a, b). ). 키네신-1에서, 촉매 코어의 α6-나선에서 연장되는 넥 링커라고 불리는 C-말단 ~ 15개 아미노산 영역은 키네신 뉴클레오티드 상태의 변화에 ​​의해 유도된 형태 변화를 겪습니다. 촉매 코어에 대한 이 넥링커의 도킹 형태는 N-키네신에 대한 주요 힘 생성 이벤트로 여겨집니다. 최근 키네신-1 모터 코어에서 튀어나온 커버 가닥이라고 불리는 N 말단 β 가닥은 '커버 넥 번들'을 형성하는 넥 링커와 상호 작용하여 미세소관을 따라 힘 생성을 조절하는 것으로 암시되었습니다. 세로23,24 및 짧은 가로 축25. 그러나 목-링커 도킹 힘 생성 메커니즘은 모든 N-키네신에서 보존되지 않습니다. 왜냐하면 키네신-6 및 -10과 같은 일부 N-키네신은 일반적인 목-링커 영역이 부족하기 때문입니다. N-키네신과 대조적으로, C-키네신 키네신-14는 모든 키네신에서 고도로 보존되는 촉매 코어의 β1-시트의 N-말단에 직접 연결된 목-나선(neck-helix)이라는 독특한 α-나선 구조를 가지고 있습니다. -14명28. 목-나선의 회전 스윙은 키네신-14의 힘 생성 및 마이너스 끝 방향성을 담당하는 것으로 가정되었으며, 이는 액틴 기반 미오신 모터 단백질에 대해 제안된 레버 암 스윙과 동일합니다. 목-나선 스윙은 여전히 ​​논란의 여지가 있습니다19,30,31,32. 또한 키네신-14에는 α6-나선에서 튀어나온 목 모방(neck-mimic)이라고 불리는 C-말단 짧은 영역도 포함되어 있습니다. 목-모방체는 아미노산 수준에서 N-키네신의 목-링커와 거의 유사하지 않지만, 키네신-14s33에 고도로 보존된 몇 가지 염기성 및 소수성 아미노산을 포함합니다. 목 모방은 야생형 kinesin-14s Drosophila melanogaster Ncd30,34 또는 Saccharomyces cerevisiae Kar335의 결정학 또는 극저온 전자 현미경 구조에서는 발견되지 않았지만 kinesin-14 구성원 KCBP(kinesin 유사 칼모듈린 결합)의 구조에서는 발견되었습니다. 단백질), 여기서 목 모방을 포함하는 C-말단 영역은 N-키네신36의 목 연결기와 동일한 방식으로 촉매 코어에 도킹됩니다. 단일 돌연변이 T436S가 있는 Ncd에서는 목 모방 영역의 처음 3개 잔기도 촉매 코어에 도킹되는 것으로 나타났습니다. 생화학적 및 운동성 분석은 또한 Ncd의 목 모방이 미세소관에 대한 Ncd 결합 친화도 및 마이너스 말단 지향 운동성을 조절할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 연구는 C-키네신의 C 말단 목 모방 영역이 플러스 엔드 방향 운동성을 위한 N-키네신의 넥 링커와 유사한 방식으로 마이너스 엔드 방향 운동성을 위한 힘 생성에도 관여할 수 있음을 시사합니다. .

 1 µm in length and did not cross each other were analyzed. A fixed bright spot on the cover glass was tracked to distinguish the displacement of microtubules by drift from the microtubule gliding driven by slow motor activity. Directionality and velocities were determined using measurements from at least three independent assays for each construct./p> 0.25 μm) along a microtubule. Those on fluctuating, bundled, or crossed microtubules were ignored. QDs that encountered other QDs were also excluded. Individual transporting velocity of each QD covered with multiple monomeric kinesins was calculated by dividing the distance travelled by the time interval (0.3–2 s) using the automated tracking software Mark255. When the QD stopped moving, the analysis was ceased at that point. Fluorescence images of QDs were fitted with a 2D Gaussian to locate the position of the intensity peak of fluorescence, corresponding to the center of the QD. Directionality and velocities were determined using measurements from at least three independent assays for each construct./p>